当今临床诊治实践对HBV检验试剂性能的新要求

时间:2019-08-10 来源: 旅游
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  作者:杨瑞锋副研究员

  单位:北京大学人民医院,北京大学肝病研究所

  从上世纪中叶到现在,HBV感染给我国民众的健康造成了巨大危害,HBV感染引起的慢性乙型肝炎仍是我国肝硬化和肝细胞肝癌的罪魁祸首。上世纪90年代起,我国开始将HBV疫苗纳入计划免疫管理,感染率迅速降低并由HBV高流行转变为中流行率国家,HBsAg血清阳性率已经降到5%以下,但慑于其余威,仍有很多人谈HBV色变。

  HBV拥有复杂而精巧的基因组结构和蛋白表达调控系统。共价闭合环状DNA(cccDNA)是病毒的“老巢”,感染后进入肝细胞核,转录4种mRNA,编码9种病毒蛋白(HBsAg、HBeAg、HBcAg、逆转录酶等),逆转录酶合成HBVDNA,整个过程非常复杂[1]。(图1部分引用参考文献[1]且已获授权)当下各种抗病毒药物,可以抑制但不能根除cccDNA,这被认为是慢性乙型肝炎不能被治愈的根本原因。

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  一、距离世界卫生组织(WHO)提出的2030年“全面消除病毒性肝炎”目标有多远?

  WHO提出的目标很宏伟,但掐指一算,仅剩10年,面对我国仍旧庞大的HBV感染人群和慢乙肝患者(约有1亿人),要能达成这一目标,首先需要加强HBV感染筛查,其次,需要科学强效的治疗。

  当前,我们处在一个乙肝治疗新旧交替的前夜,各种新型的靶向治疗药物层出不穷,但进入市场还需时日,而注射长效干扰素和口服强效、低耐药核苷(酸)类似物,仍然是当今主流的治疗方案,多年来不曾有突破性进展。

  在今年的7月28日,也就是第9个世界肝炎日来临之际,如何在现今治疗方案框架下,充分利用HBV检验标志物指导药物选择和疗效预测,是摆在我们每一位乙肝相关临床、科研和体外诊断技术人员面前的重要议题。

  二、HBV血清和分子生物学标志物不断被“翻炒”——凸显抗HBV治疗仍无革命性进展

  近年来,很多抗病毒治疗中HBV相关“新型”标志物得到了充分研究,成果不断见诸肝病的权威期刊,如HBV前基因组RNA(pgRNA)、核心相关抗原(HBcrAg)和核心抗?澹℉BcAb)定量等等,体现了我国在乙肝领域的研究水平已经得到了国际的认可[2];然而,这些“新型”指标越多,越凸显当前慢乙肝治疗,仍未取得像直接抗病毒药物(DAA)根治丙肝那样革命性的突破,所以我们只能继续在原有格局上“深耕细作”,寄希望于检测更多更复杂的标志物组合,在有限的空间里,试图进一步优化现有的治疗方案。

  例如,pgRNA和HBcrAg理论上可以用于指示口服抗病毒药物停药,不过,随着一线口服药物(如恩替卡韦)价格的飞速降低,长期治疗的经济负担几乎可以忽略不计,因此,这些用于预测停药指标的检测需求也会受到打击。

  三、HBV感染诊断和治疗相关的几个核心检验指标——地位依然稳固

  慢乙肝抗病毒诊断和治疗最核心的指标,还是我们熟知的乙肝“两对半”和HBVDNA。严格说,“乙肝”、“两对半”并非专业术语,但便于公众理解起见,本文仍沿用这些称谓。

  1、HBsAg、HBV DNA和HBcAb是最重要的HBV感染筛查标志物

  HBsAg是我们最熟悉的筛查标志物,但其灵敏度有一定局限性。近年来,我国已逐渐实现在血站同时使用高敏HBsAg(如使用基于化学发光技术的试剂)和HBVDNA两种试剂筛查献血者。引入HBVDNA检测,可进一步降低隐匿性HBV感染(OBI)和急性乙肝通过献血传播HBV的风险。

  OBI的定义为,现有的灵敏试剂检测HBsAg为“阴性”,但肝脏细胞内存在具有完整复制活性的松弛环状DNA(rcDNA,即一般意义上的HBVDNA)或cccDNA,或能在血清中检测到HBVDNA,不过,血清DNA往往水平极低(<200IU/mL)[3,4]。大部分OBI血清HBcAb为阳性,但也有血清学阴性的OBI。

  HBcAb并非保护性抗体,阳性提示既往或现症感染。在美国等HBV感染低流行率国家,HBcAb阳性的血液也不能用于输血或制作血液制品,这主要是出于对HBcAb阳性OBI献血者的顾虑。在我国,由于一般人群HBcAb流行率高达30-40%,因此并不排除HBcAb阳性的献血者。

  在临床,HBcAb阳性患者,如果免疫系统正常,一般情况下可不予特殊处理,但患者如果是造血干细胞或实体器官移植受者,或因肿瘤、胃肠道、风湿或皮肤疾病而需要接受anti-CD20、anti-TNF、长期类固醇或其他免疫抑制剂治疗,或因癌症而接受系统性化疗,则应将其分为HBV再激活的高、中和低风险人群,积极监控病毒指标,必要时启动预防性抗病毒治疗,从而避免HBV再激活导致的肝脏损伤[5]。

  2、HBsAg、HBeAg和HBV DNA指示慢乙肝抗病毒治疗的三个“终点”的标志物

  以目前主流的口服抗HBV药物治疗为例,压制病毒复制、使HBVDNA转阴较易实现,这是慢乙肝治疗的基本终点;HBeAg转阴(即“大三阳”转为“小三阳”)是满意的终点;而HBsAg转阴和/或HBsAb的产生,则是理想的终点。但遗憾的是,当前只能有少数患者可达到理想终点。这些标志物联合,可帮助临床选择治疗方案(干扰素还是口服药),判断抗病毒治疗疗效,以及调整治疗方案。

  四、HBV血清学标志物(“两对半”)应和HBV DNA一样,实现“定量”检测[6]

  1、HBsAg定量(qHBsAg)应尽快推广

  ?qHBsAg定量比HBV DNA更准确地反映cccDNA活性,以及免疫系统对HBV的清除力。

  如前所述,cccDNA是HBV盘踞的“老巢”,cccDNA式微,则意味着HBV感染趋于被控制。qHBsAg比HBVDNA更准确地反映cccDNA的量和活性[7],同时,qHBsAg也反映人体免疫系统对病毒抗原的控制力,水平越高,则说明控制力越弱,甚至引起免疫耐受,致使感染延长;反之亦然。

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  ?qHBsAg有重要的临床预测价值

  qHBsAg的预测价值体现在,第一,在HBV感染自然进程中(即没有治疗干预),可帮助判断感染阶段(高复制期、免疫清除期还是非活动期?),可帮助预测疾病进程与结局(罹患肝硬化和肝细胞肝癌的风险有多大?),还可用于预测HBsAg清除率——可以简单理解为:qHBsAg越低越好。

  第二,抗病毒治疗过程中,qHBsAg帮助选择治疗方案、预测治疗应答——可以简单理解为,治疗前qHBsAg水平越低、治疗过程中降得越快,疗效越佳。

  具体来说,对长效干扰素治疗而言,qHBsAg检测是必要的,其“阴性预测价值”更大,换句话说,干扰素治疗必须要使qHBsAg水平降低,如果治疗半年后HBsAg无明显降低,或仍然> IU/mL,表明干扰素疗效差,应停止干扰素治疗。

  另一方面,口服药物治疗则以遏制HBVDNA复制为首要目的,不强求qHBsAg迅速降低,但一旦治疗中发现qHBsAg显著降低,则提示有很好的疗效,应鼓励患者继续治疗,而不要轻易停药,持续稳定的HBsAg下降甚至可能预示能清除HBsAg,达到满意的治疗终点,此种情形下qHBsAg的“阳性预测价值”更大。

  放眼未来,很多中外制药公司对根治HBV感染药物的研发热情高涨,将来的某种新药,可能彻底攻克HBV感染,清除HBsAg甚至清除cccDNA,不妨畅想,到那时,qHBsAg可能成为仍需要监测的为数不多的“治愈”指标之一。

  ?HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb定量也有一定的临床意义

  除HBsAg外,其他血清学标志物定量也有一定的临床意义,总结于表1。

  表1 HBV血清学标志物(除HBsAg)定量检测的临床意义

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  ?目前市面上HBV血清学标志物定量的试剂概览

  部分进口和国产试剂已经可实现血清学标志物的“全定量”(表2),但临床广泛应用尚需进一步的临床研究、验证及宣传推广。

  表2 当前市场主流的HBV定性或定量血清学标志物检验试剂概览

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  五、高敏HBV DNA检测方法——临床重要性无可替代

  1、各大肝病学会均推荐使用“高敏”HBV DNA检验试剂

  目前全球各肝病学会均推荐使用10~12 IU/mL检测下限的HBVDNA检验试剂,这是考虑到,高灵敏度HBVDNA试剂有其重要的价值。

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  2、献血者供血中极微量的病毒(0.15 IU/mL HBV DNA)即可导致传染

  来自欧洲的一项大规模血站调研结果表明,献血者血液中如果检测到总量为16拷贝或3IU(也即,0.8拷贝/mL或0.15 IU/mL)的HBVDNA,即可导致受血者被感染[10]。当前主流的HBVDNA定性或定量检测试剂的灵敏度,都远远达不到这个灵敏度。

  不过,是否需要进一步提高灵敏度,需考量成本效益问题,同时,也需考虑到,极高灵敏的检验试剂,也更容易受样本交叉污染和气溶胶污染等的影响。但无论如何,HBV有如此强的传染性,还是进一步刷新了我们的认知,也提示我们,只要测得准,HBVDNA试剂可能再灵敏都不为过。

  3、诊断OBI和预防免疫缺损人群HBV再激活——也需高灵敏HBV DNA试剂

  HBV再激活主要发生于免疫系统缺损的、非活动性HBsAg携带者或OBI患者。如前所述,OBI患者血清HBVDNA一般载量极低(<200IU/mL),诊断OBI依赖于灵敏的HBVDNA试剂。HBV再激活的诊断,同样依赖于HBVDNA检测。HBV再激活的定义并不完全统一,但大同小异。若HBVDNA基础值为阳性,在此基础上增高10-100倍便可诊断再激活;缺乏基线HBVDNA者HBVDNA≥ IU/mL也可诊断;若基线HBVDNA为阴性但转阳,亦可诊断再激活[5,11,12]。OBI和再激活的诊断,都涉及HBVDNA诊断试剂的检测下限问题——高灵敏HBVDNA试剂助力准确诊断OBI,也有助于尽早诊断HBV再激活,降低再激活导致的危害。

  4、今后需要更积极治疗乙肝——启动抗病毒治疗的HBV DNA界定值趋于越来越低

  现今的乙肝治疗指南,已将乙肝肝硬化患者的治疗指征,从以前的HBVDNA>200 IU/mL拓展为“HBVDNA阳性”即启动治疗。

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  随着以恩替卡韦为代表的廉价、强效、低耐药的口服药物的普及,抗病毒治疗的适应患者群可能会进一步拓展。例如,如果HBV感染者出现持续的肝脏炎症(例如ALT升高)且排除其他原因引起的肝炎,现有指南推荐HBVDNA>2000 IU/mL(HBeAg阴性)或IU/mL(HBeAg阳性)方启动抗病毒治疗[12],可能在未来更新的指南中,同样也是HBVDNA阳性即启动治疗,从而更早控制病毒复制,减少肝硬化和肝细胞肝癌的发生率。此时也需借助灵敏的HBVDNA试剂。

  5、核酸检测全自动化是趋势

  目前的核酸检测技术以基于Taqman探针的实时定量技术占绝对主导地位(表3),但依赖核酸序列扩增(NASBA)、转录介导扩增(TMA)等恒温扩增技术,以及数字微液滴扩增技术(ddPCR)等,亦有一定的市场份额,各技术平台应紧密贴合临床和血站的检验日常需求,核酸提取、PCR和结果分析的全程自动化是核酸检测的必然趋势,拥有自动化操作平台、内部质控参数完备(比如对内标Ct值的严格限定、对PCR扩增曲线的具体限定等)、严格的防污染措施的品牌,会在市场竞争中获得优势。

  表3 国内外常见HBVDNA试剂的灵敏度

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  [1] Virus Research. 2016, 213:205-13.

  [2] 肝脏,2019,24:483-6.

  [3] J Hepatol. 2019, doi: 10.1016/j.jhep.2019.03.034.

  [4] 中华预防医学杂志. 2019, doi:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2019.05.002.

  [5] Gastroenterology. 2017, 152:1297-1309.

  [6] 中华检验医学杂志. 2009,32:967-70.

  [7] J Hepatol. 2010;52:475-7.

  [8] J Gastroenterol Hepatol. 2010, 25:1498-506.

  [9] J Hepatol. 2019, 70:793-5.

  [10] Gut. 2019,68:313-21.

  [11] Gastroenterology. 2015,148:215-9.

  [12] 中华肝脏病杂志.2015,23:888-905.

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